Le specie reattive dell’ossigeno e gli antiossidanti tiolici, incluso il glutatione (GSH), regolano l’immunità innata a vari livelli. Questa recensione delinea i passaggi sensibili al redox dei meccanismi cellulari implicati nell’infiammazione e nella difesa dell’ospite contro le infezioni e descrive come GSH non sia importante solo come antiossidante ma anche come molecola di segnalazione. Esiste una vasta letteratura sul ruolo di GSH nell’immunità. La maggior parte delle recensioni sono distorte da un quadro semplificato in cui i radicali liberi “cattivi” causano ogni tipo di malattia e gli antiossidanti “buoni” ne proteggono e prevengono lo stress ossidativo. Anche se questo può essere il caso in alcuni campi (ad es. Tossicologia), il ruolo dei tioli (l’argomento di questa recensione) nell’immunità richiede certamente di indossare gli occhiali da scienziato e di essere pronti ad accettare un quadro più complesso. Questa recensione ha lo scopo di descrivere il ruolo di GSH nel polmone nel contesto di immunità e infiammazione. La prima parte riassume la storia e i concetti di base di questa immagine. La seconda parte si concentra sul metabolismo / livelli di GSH in patologia, la terza sul ruolo di GSH nell’immunità e nell’infiammazione innate, e la quarta fornisce 4 esempi che descrivono l’importanza di GSH nella risposta alle infezioni.

IMMUNITÀ E INFIAMMAZIONE INNATE, DUE FACCE DELLA STESSA MEDAGLIA BIOLOGICA

La prima linea di difesa immunitaria contro i patogeni, prima che si sviluppi l’immunità adattativa (anticorpi, risposte delle cellule T), si chiama immunità innata. Questo è un insieme complesso di risposte innescate quando cellule specifiche (macrofagi, fagociti, cellule dendritiche) riconoscono anche un patogeno ancora sconosciuto da alcune caratteristiche comuni alla maggior parte dei patogeni (queste “firme” sono chiamate modelli molecolari associati ai patogeni) attraverso una famiglia di patogeni recettori di riconoscimento. Ciò attiva una risposta che comporta la produzione di ROS, un importante meccanismo battericida e di mediatori solubili (citochine) il cui ruolo è quello di amplificare la risposta dell’ospite reclutando e attivando altre cellule del sistema immunitario.
Questo aspetto della risposta immunitaria innata è anche noto, da una prospettiva diversa, come risposta infiammatoria. Fondamentalmente, gli stessi meccanismi e mediatori della difesa dell’ospite sono implicati nella patogenesi delle malattie infiammatorie (non infettive) e l’inibizione di questi meccanismi è la chiave del meccanismo d’azione dei farmaci antinfiammatori.
Molte malattie non infettive del sistema respiratorio, tra cui asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), fibrosi cistica, fibrosi polmonare idiopatica (IPF) e tossicità dell’ossigeno, hanno una componente infiammatoria. L’infiammazione è anche implicata nella tossicità polmonare dell’ozono, dell’amianto, della silice, del fumo di sigaretta e del particolato. Una risposta infiammatoria esagerata è anche coinvolta nella patogenesi o nelle complicanze delle infezioni polmonari come la tubercolosi, la sindrome respiratoria acuta grave, l’influenza e la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS).

METABOLISMO DEL GLUTATIONE NELLE MALATTIE

SINTESI GSH E SUOI PRECURSORI

GSH è sintetizzato dai suoi 3 aminoacidi con una via biosintetica mostrata in Figura 4 . Uno studio sull’uomo, usando i radioisotopi, 3 ha dimostrato che la disponibilità di cisteina e il suo precursore metionina è il fattore limitante della velocità nella sintesi di GSH. In generale, si presume che i due principali fattori limitanti siano i livelli di cisteina e dell’enzima gamma-glutamil-cisteina sintetasi (noto anche come glutammato-cisteina ligasi).

DEFICIT E IMMUNITÀ GENETICI DI GSH

Il deficit di glutatione sintetasi (GS) (oxoprolinuria) è un raro disturbo autosomico recessivo che colpisce circa 70 pazienti nel mondo. I pazienti con grave carenza di GS mostrano, tra le altre condizioni, una maggiore suscettibilità alle infezioni batteriche.
Un caso clinico ha mostrato che i neutrofili di un bambino con deficit di GS subiscono un danno ossidativo in caso di fagocitosi, indicando che GSH è importante per difendere i neutrofili dai ROS che producono come parte del loro armamentario microbicida. Da notare che i neutrofili di pazienti con deficit di GS, nonostante la normale fagocitosi e un aumento del rilascio di perossido di idrogeno, sono meno efficienti nell’uccidere i batteri, indicando un ruolo di aiuto per GSH nell’attività battericida.

CARENZA E IMMUNITÀ GSH ACQUISITE

Molte condizioni patologiche sono associate a livelli ridotti di GSH. Ciò potrebbe essere dovuto a diversi motivi. Ad esempio, lo stress ossidativo potrebbe causare la perdita di GSH attraverso l’ossidazione. Un altro aspetto importante è la nutrizione, poiché è stato dimostrato che, anche quando l’assunzione di proteine nella dieta è sufficiente per mantenere l’equilibrio dell’azoto, potrebbe non essere sufficiente per mantenere il GSH cellulare, in particolare in condizioni di stress ossidativo. La carenza di GSH potrebbe anche derivare da problemi metabolici. Ad esempio, nei pazienti con AIDS, è stata segnalata una diminuzione dell’attività gamma-cistationasi nel fegato.

L’uso di radioisotopi stabili ha permesso la caratterizzazione del metabolismo della cisteina e la sintesi di GSH nei pazienti settici. Questo studio ha dimostrato che la sepsi riduce la sintesi di GSH nel sangue del 60%. Da notare che questi pazienti avevano un apporto di aminoacidi solforati inferiore a quello raccomandato dall’Organizzazione Mondiale della Sanità. Studi condotti su modelli animali hanno riportato un aumento del fabbisogno di cisteina nella sepsi, probabilmente a causa di un aumento del turnover di GSH, poiché la sintesi di GSH rappresenta il 40% dell’aumento dell’utilizzo della cisteina. Questi e altri studi dimostrano che anche quando l’assunzione dietetica di cisteina è sufficiente per la sintesi proteica (bilancio dell’azoto), potrebbe non essere sufficiente mantenere livelli adeguati di GSH. Si dovrebbe anche tenere presente che le condizioni infettive e infiammatorie sono associate ad un aumento della produzione di proteine della fase acuta da parte del fegato, ed è stato stimato che rappresentano in modo significativo l’aumento dell’utilizzo di aminoacidi solforati, in concorrenza con GSH.

GSH COME REGOLATORE DELL’IMMUNITÀ INNATA

RUOLO ANTINFIAMMATORIO DI GSH NELLE MALATTIE POLMONARI

L’idea che GSH possa svolgere un ruolo antinfiammatorio è diventata popolare negli anni ’90 con uno studio di Schreck et al. che mostra che gli antiossidanti inibiscono, mentre i ROS attivano il fattore di trascrizione NF-κB che comanda la trascrizione di diversi geni infiammatori, 16 a ruolo che è stato confermato nel polmone.

In effetti, un ruolo protettivo di GSH contro le patologie infiammatorie del polmone è stato dimostrato dall’effetto protettivo di diversi precursori di GSH in vari modelli animali.

GSH È ESSENZIALE PER LE FUNZIONI IMMUNITARIE INNATE E ADATTIVE

Le funzioni di GSH non sono solo inibitorie come descritto sopra per la risposta infiammatoria. Infatti, GSH è essenziale per alcune funzioni del sistema immunitario, sia innato che adattivo, tra cui la proliferazione dei linfociti T, attività fagocitica di neutrofili polimorfonucleari (PMN), e funzioni cellulari dendritiche, ed è anche importante per primo passo dell’immunità adattativa, consistente nella presentazione dell’antigene da parte delle cellule presentanti l’antigene (APC). Infatti, l’immunità cellulo-mediata richiede che gli antigeni proteici vengano prima degradati nelle vescicole endocitiche degli APC (ad es. Macrofagi, cellule dendritiche), in modo che i peptidi più piccoli possano essere presentati sulla superficie cellulare dal principale complesso di istocompatibilità per attivare la proliferazione dell’antigene cellule T specifiche. Uno dei primi passi nella degradazione e nell’elaborazione dell’antigene è la riduzione dei legami disolfuro, che richiede GSH. Va anche notato che sebbene GSH inibisca la produzione della maggior parte delle citochine infiammatorie, è necessario mantenere un’adeguata produzione di interferone-gamma (IFN-gamma) da parte delle cellule dendritiche, che è essenziale per la difesa dell’ospite contro agenti patogeni intracellulari come micobatteri.

Questo ruolo essenziale di GSH nell’immunità potrebbe spiegare perché in molte malattie, non solo nell’AIDS, i livelli ridotti di GSH sono associati ad una maggiore suscettibilità alle infezioni. Questi includono BPCO, fibrosi cistica, infezione da influenza, e alcolismo, poiché l’etanolo compromette l’equilibrio Th1 / Th2 tramite deplezione di GSH.

GSH E DIFESA IMMUNITARIA CONTRO LE INFEZIONI: QUATTRO ESEMPI

ESEMPIO 1: INFEZIONI VIRALI – STRESS OSSIDATIVO E PATOGENESI DELL’INFLUENZA

Il ruolo dello stress ossidativo nel danno polmonare da virus dell’influenza è ben caratterizzato nel modello murino. I topi infetti da influenza mostrano un danno polmonare associato a una drammatica riduzione dei livelli polmonari di GSH, nonché ad un aumento dei marcatori di stress ossidativo come il glutatione ossidato (GSSG) e i perossidi lipidici. In questi topi, lo stress ossidativo potrebbe essere dovuto all’induzione della xantina ossidasi, un noto enzima che genera superossido. Inoltre, l’infezione influenzale è associata a un’induzione di citochine infiammatorie, che potrebbero rappresentare un probabile passaggio sensibile alla GSH nella sua patogenesi. Tra gli antiossidanti dimostrati protettivi nei modelli animali di influenza vi sono l’inpurinolo xantina-ossidasi allopurinolo, quercetina, superossido dismutasi, tioredossina, NAC (da solo o con ribavirina o oseltamavir ) e GSH stesso. Uno studio ha riportato che la proteina M2 del virus dell’influenza aumenta la produzione di ROS nelle cellule delle vie respiratorie umane in vitro, causando effetti tossici che sono prevenuti dall’aggiunta di estere GSH. Sebbene questi studi indicano un ruolo protettivo di GSH a livello della patogenesi del danno polmonare, è stato riferito che BSO aumenta la replicazione virale, implicando un possibile ruolo antivirale di GSH endogeno. Uno studio clinico ha dimostrato che la somministrazione di NAC migliora i parametri dell’immunità cellulo-mediata nei pazienti con influenza, suggerendo una possibile rilevanza clinica di queste osservazioni.

ESEMPIO 2: AIDS – IMPORTANZA DI GSH NELL’IMMUNITÀ

Storicamente, l’intero campo del ruolo di GSH nell’immunità e il suo effetto sull’NF-κB ha ricevuto la spinta più forte dagli studi sull’AIDS, in particolare da uno studio del gruppo di Wulf Droge che ha dimostrato che i pazienti con AIDS hanno una bassa concentrazione di cisteina plasmatica. Le ragioni di ciò non sono chiare, ma i pazienti con AIDS hanno un deficit nell’enzima gamma cistationione, che sintetizza la cisteina dalla metionina. Ricerche successive hanno dimostrato che l’AIDS provoca una diminuzione del GSH intracellulare nelle cellule T CD4 e che un basso GSH è associato a una ridotta sopravvivenza.

I livelli più bassi di GSH nei pazienti con AIDS potrebbero avere varie conseguenze. La deplezione di GSH, almeno in vitro, aumenta la replicazione dell’HIV, mentre il suo precursore NAC blocca l’effetto stimolante del fattore di necrosi tumorale sulla replicazione dell’HIV. 70 Inoltre, l’effetto neurotossico delle proteine HIV Tat e gp120 è associato a stress ossidativo e antagonizzato dalla NAC.

ESEMPIO 3: INFEZIONI BATTERICHE – TUBERCOLOSI

Mycobacterium tuberculosis è un patogeno intracellulare che cresce nei fagosomi, dove è protetto da effettori del sistema immunitario come anticorpi e linfociti T. Anche se la letteratura che mostra che i livelli di GSH sono più bassi nei pazienti con tubercolosi risale agli anni ’50, non è stato fino alla ricerca di Venketaraman e colleghi che è stato studiato in profondità l’effetto di GSH sull’infezione da M. tuberculosis . Utilizzando una linea cellulare di macrofagi di topo, gli autori mostrano che l’IFN-gamma e l’endotossina aumentano sia la produzione di ossido nitrico (NO) sia l’attività battericida; la riduzione parallela di GSH suggerisce che GSH reagisce con NO per formare S-nitrosoglutatione (GSNO). In queste condizioni sperimentali, l’esaurimento di GSH con BSO ha inibito l’attività microbicida dei macrofagi mentre il suo precursore NAC ha aumentato l’uccisione intracellulare di micobatteri anche da macrofagi umani, che normalmente non sono molto efficaci nell’uccidere i micobatteri. Altri ricercatori hanno dimostrato che la via della trans-solforazione, che converte la metionina in cisteina e ha un ruolo chiave nel mantenimento della cisteina, e quindi dei livelli di GSH, è essenziale per uccidere i micobatteri. In quello studio, è stato scoperto che non solo gli enzimi della via trans-solforazione sono aumentati nei monociti umani in risposta ai micobatteri, ma il loro inibitore propargilglicina ha abbassato i livelli di GSH e ha inibito la clearance dei micobatteri e la fusione di fagolisosoma, mentre li ha aumentati. Risultati simili sono stati ottenuti in colture di sangue intero umano. In vitro, sia GSH che GSNO hanno un’attività battericida diretta contro questi agenti patogeni.
Questa complessa immagine è stata ben rivista da Connell e Venkataraman. L’esaurimento di GSH (da parte di BSO o dietilmaleato) inibisce anche l’attività leishmanicida dei macrofagi, nonché la produzione di NO, mentre il precursore GSH-estere etilico GSH li ripristina, suggerendo che il requisito per il percorso GSH / NO potrebbe essere una caratteristica comune di resistenza ai patogeni intracellulari.

ESEMPIO 4: SEPSI E SUE COMPLICANZE – GSH COME MOLECOLA REGOLATRICE

L’ARDS è una delle complicanze più gravi nei pazienti settici in condizioni critiche. Molti studi hanno evidenziato un ruolo dello stress ossidativo nell’ARDS e hanno mostrato un effetto protettivo dei precursori del GSH.
La maggior parte degli studi di ARDS su modelli animali, compresi quelli citati sopra, si basano sulla somministrazione di lipopolisaccaride (LPS), un’endotossina batterica. Nei topi, la somministrazione di LPS induce una lesione polmonare acuta simile alle ARDS cliniche, con produzione di citochine infiammatorie, infiltrazione dei leucociti nei polmoni e edema polmonare. In questo modello, vari antiossidanti a base di tiolo sono protettivi. Tuttavia, la somministrazione di LPS è in realtà un modello di shock endotossico, che non coinvolge batteri vivi, per indurre uno stato simile a quello che una volta era chiamato shock settico ed è ora definito come sindrome da risposta infiammatoria sistemica.
Tuttavia, nei pazienti settici, la sopravvivenza è influenzata da 2 contributi opposti dell’immunità innata: l’immunità innata è dannosa come l’infiammazione sistemica, che provoca ARDS e shock, ma d’altra parte è una componente essenziale della difesa immunitaria contro l’infezione. È difficile prevedere in che modo GSH influisce su questo equilibrio.
Un altro modello animale realistico è quello indotto dalla legatura e dalla puntura cecali (CLP), in cui la perforazione del cieco provoca il rilascio di materiale fecale nel peritoneo che provoca una sepsi peritoneale polimicrobica. Questo modello consente di studiare la rilevanza di entrambe le braccia dell’immunità innata, quella dannosa e protettiva.
Abbiamo usato questo modello per studiare il ruolo del GSH endogeno nella sepsi. 86 In questo modello, il CLP ha indotto l’infiltrazione di PMN nella cavità peritoneale, nel sito di infezione, così come nel polmone, causando infine lesioni polmonari e morte, con una concomitante diminuzione del GSH endogeno. Abbassare ulteriormente GSH con BSO ha peggiorato le impostazioni cliniche. Non solo la BSO ha aumentato l’infiltrazione di PMN nei polmoni, ma ha anche diminuito l’infiltrazione di PMN nel sito di infezione, aumentando così la crescita batterica. Di conseguenza abbiamo avuto più infiammazione e meno immunità e la sopravvivenza è stata drasticamente ridotta. La sostituzione di GSH con NAC ha avuto l’effetto opposto di ridurre l’infiltrazione di PMN nel polmone ma aumentandola nel sito di infezione, riducendo così le colonie batteriche.
L’immagine che emerge da questi esperimenti è che il GSH endogeno non è solo un inibitore dell’infiammazione, ma è necessario per consentire una corretta risposta alle infezioni e “dirigere” la migrazione del PMN infiammatorio lontano dal polmone, dove causano ARDS, e verso il sito di infezione, dove uccidono i batteri.
L’idea, quindi, è che GSH non sia solo un inibitore dell’infiammazione ma anche un regolatore dell’immunità innata in una direzione favorevole all’ospite.

CONCLUSIONI: GSH DA UN SEMPLICE SCAVENGER DI RADICALI LIBERI A UNA MOLECOLA REGOLATRICE

Parallelamente agli studi di GSH sull’immunità, studi molecolari e biochimici più complessi hanno evidenziato un ruolo regolatorio di GSH. Questo è stato il risultato di un’evoluzione dal concetto di stress ossidativo delineato sopra a quello di regolazione redox. Il concetto di regolazione redox implica che alcuni cambiamenti ossidativi (come i cambiamenti nello stato redox delle cisteine proteiche) non sono necessariamente dannosi ma possono avere proprietà regolatorie. Mentre questa idea mostra un quadro più complesso di quello popolare in cui i radicali liberi e gli ossidanti sono cattivi e gli antiossidanti sono buoni, implica che GSH è una molecola essenziale non solo nell’azione come antiossidante, ma anche in assenza di stress ossidativo, come molecola di segnalazione endogena. I meccanismi molecolari della regolazione redox mediata da GSH sono oggetto di attenta indagine e sono stati in parte identificati.
Sebbene la presente revisione si concentri sull’immuno patogenesi delle malattie polmonari, i concetti chiave qui descritti possono aiutare a interpretare il ruolo del redox in altre condizioni patologiche.

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